Isolation and Characterization of Antimicrobial Agent Producing Microbes and Generation of Metagenomic Libraries from Diverse Forest Soils in Puerto Rico

Abstract

The misuse of antimicrobial agents is a world wide issue, since many opportunistic bacteria have acquired resistance or are becoming resistant to commercially available antibiotics. Antimicrobial resistance is not limited to clinical opportunistic bacteria but also is a concern for the agro economic sector. Many soil microbes have also obtained resistance and are less susceptible to antimicrobials and antifungals used for plague management. That is why the search for novel antimicrobial agents is of major importance. Bioprospecting is the search for novel biotic systems that will serve as a source of molecules with biotechnological potential. Many ecosystems, such as soils, are being exploited in order to bioprospect for activities such as antibiotic production. To complete this task general microbiological techniques are used but also, since not even 1% of the entire soil population can be cultured, research groups are using functional genomics to access the uncultivable microbes. The main goal of our research was the isolation and characterization of Antimicrobial Agent Producing Microbes (AAPM) and the generation of soil metagenomic libraries for the isolation of antimicrobial agent encoding genes. Soil samples were obtained from three forests in Puerto Rico. We isolated a total of 185 AAPM from soil samples by using serial dilutions and the crowded plate technique forty of the AAPM showed antagonistic capabilities toward enteric and non-enteric opportunistic bacteria used as targets which included Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, and Staphylococcus epidermidis. The capability of antimicrobial production of the isolated microbes was determined by using a modified version of the Kirby Bauer susceptibility test, the radial inhibition, and the streak technique, among others. The top ten antagonists were chosen for further molecular, microbiological and biochemical characterization. Our data indicates that a group of the top ten isolates belong to the Pseudomonas spp. and Bacillus spp. A preliminary study demonstrated that one of the isolates has biocontrol capabilities, by inhibiting the pathogenic fungi Rhizoctonia solani. In a green house experiment we determined that two of the microbes inhibited necrosis formation in the plant Phaseolus vulgaris and also had the capability of acting as a Plant Growth Promoting Rhizobacteria. Two soil metagenomic libraries of the forest soils were generated and screened for antibiosis. Even though antimicrobial activity was not detected, one of the clones was able to grow in minimal media supplemented with three different carbon sources. Through this study we have constructed the first Puerto Rican soil metagenomic library and have obtained a collection of forest soil AAPM with clinical, agricultural and biotechnological potential.

El uso indebido de agentes antimicrobiales ha causado el incremento de poblaciones microbianas resistentes a diversas drogas. La resistencia a los antibióticos no está limitada tan solo a oportunistas clínicos sino también a bacterias de importancia agrícola ya que muchos microorganismos residentes del suelo han adquirido resistencia volviéndose menos susceptibles a sustancias para su manejo. Estas son las razones que justifican la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos. Se conoce por “bioprospecting” cuando un sistema biótico es explotado con el propósito de conseguir biomoléculas de importancia biotecnológica. Diversos ecosistemas incluyendo el suelo están siendo explotados para conseguir nuevos microorganismos productores de agentes antimicrobiales. No todos los microorganismos de suelo pueden ser aislados mediante técnicas microbiológicas convencionales, así que se están empleando técnicas moleculares que permitan el acceso del material genético del 99% de las comunidades no cultivables, presentes en el suelo. El propósito principal de esta investigación fue el aislamiento y la caracterización de microorganismos productores de agentes antimicrobiales (MPAA) y la generación de bibliotecas metagenómicas de suelo para el monitoreo de genes que codifiquen para sustancias antimicrobiales. En esta investigación se trabajó con suelo proveniente de tres bosques. Dichos suelos fueron procesados mediante diluciones en serie de donde se aislaron 185 MPAA. Se realizaron diversas pruebas de susceptibilidad donde se determinó que cuarenta de los antagonistas inhibieron efectivamente los siguientes patógenos oportunistas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis. La habilidad en la producción de sustancias inhibitorias fue estudiada mediante una modificación del método Kirby Bauer, la prueba de inhibición radial y la técnica del rayado inhibitorio entre otros. Los mejores diez antagonistas fueron caracterizados molecular y fisiológicamente. Los datos indican que dentro de los mismos existen miembros del género Bacillus sp. y Pseudomonas sp. Dos de los MPAA mostraron la habilidad de inhibir al hongo Rhizoctonia solani. Se realizó un experimento de invernadero donde se determinó que estos dos MPAA inhiben la formación de necrosis en la planta Phaseolus vulgaris y que actúan como “Microorganismos Promotores de Crecimiento en Plantas” (MPCP). Dos bibliotecas metagenómicas de suelo fueron construidas y monitoreadas para la producción de antibióticos. Aunque no se logró observar actividad antimicrobial en las mismas se identificó un transformante que mostró la capacidad de crecer en medio de cultivo mínimo suplementado con tres fuentes de carbono distintas. Mediante este estudio se han generado las primeras bibliotecas metagenómicas de suelo puertorriqueño y se ha logrado generar una colección de MPAA provenientes de suelo de bosque los cuales poseen potencial en las áreas de la agricultura, clínica y biotecnológica.