Cambios en parametros de motilidad en espermatozoides bovinos inhibiedo diferentes vias metabolicas durante la capacitacion

Abstract

The production of beef cattle in Puerto Rico has remained low during the last fifteen years; meanwhile, the demand of this product remains high, depending greatly on importations. The decline in the number of cattle and beef production in the country is notable. Performing assisted reproduction techniques is a strategy to improve local production, so it is essential to know the physiology of the sperm cell. The present study evaluated the mitochondrial function of bovine spermatozoa during in vitro capacitation by using enzymatic inhibitors [(IE); 3-chloro-1,2-propanediol (3MCPD), Sodium Oxamate (SOXAM), 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)] and electron transport chain uncouplers [(DES); Rotenone (Rot) and Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)]. Control treatments [capacitating medium (MC) and MC+dimethylsulfoxide (MC+DMSO)] were used to compare the effect with a non-capacitating medium (MNC). Semen from four Senepol bulls was collected by electroeyaculation, incubated for 4 h at 37° C in a 5% CO2 atmosphere, and analyzed (1x/Hr) using the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system to evaluate the following parameters: motility (MOT), curvilinear velocity (VCL), amplitude of lateral head displacement (ALH), beat-cross frequency (BCF), and linearity (LIN). Data were analyzed using the Proc Mixed in SAS (Statistical Analysis System). There was no interaction between treatment and time for the motility-related parameters evaluated. Although, a treatment effect for MOT, VCL, ALH, BCF and LIN (P<0.05) was observed. Similarly, an effect of Hr (P<0.05) was found. Values for BCF increased, while values for MOT, VCL and ALH decreased, indicating sperm hyperactivation through time during the capacitation; for LIN, the values did not demonstrate a pattern. The established controls, MC and MC+DMSO, did not show differences between themselves for any of the motility parameters (P>0.05). Although, between these and the MNC there was a difference for all the parameters (P<0.0001), except for LIN (P=0.6999). The sperm were negatively affected according to the hours of incubation regardless of the treatment: MOT, VCL, ALH, BCF and LIN (P<0.05). On the other hand, using IE vs. MC had no effect for MOT and ALH (P=0.0829 and P=0.1865, respectively); there were differences (P<0.05) however, for VCL, BCF and LIN. For VCL, SOXAM had greater values than MC (P=0.0299) and 3MCPD (P=0.0168); the later was also lower than DNFB (P=0.0364). There was no difference for VCL between MC vs. 3MCPD and DNF (P=0.9977 and P=0.0612, respectively). Even so, MC was less than 3MCPD for BCF (P=0.0583). Sperm treated with SOXAM and DNFB showed a higher percentage of linearity than MC (P=0.0014 and P=0.0443, respectively) and 3MCPD (P=0.0017 and P=0.0513, respectively). These IE caused a significant decrease for MOT, VCL, and ALH between the 1-4 hours of incubation with a difference of 25.19%, 48.51μm/sec, 1.81μm, respectively (P<0.0001). However, BCF increased 4.57Hz (P<0.0001) and LIN was not relevant (P=0.3388). When using DES, compared to MC+DMSO, CCCP reduced 7.61% on MOT (P=0.0115) and 2.55% on LIN (P=0.0075). On the other hand, VCL decreased 13.84μm/sec when the sperms were treated with ROT (P=0.0071). Sperms exposed to ROT and CCCP showed no differences in the parameters of ALH and BCF (P=0.1860 and P=0.3388, respectively). The uncouplers had a significant impact over time causing a decrease in MOT, VCL, and ALH between the 1-4 hours of incubation with a difference of 24.33%, 41.29μm/sec and 1.56μm, respectively (P<0.0001). On the other hand, BCF increased 5.45Hz (P=0.0004) and LIN did not show difference (P=0.4793). These results suggest that bovine sperms can maintain their motility in both conditions, aerobic and anaerobic; although they confirm that their main metabolic pathway is cellular respiration, as long as they have available glycosoluble substrate. Finally, a good management of the sperm improves its fertilizing capacity, probably helping with reduced fertility problems in cattle. This strategy could contribute to improve reproductive performance, and in this way, promote the local production and consumption of beef, which may help the country's economy.

La producción de ganado de carne en Puerto Rico se ha mantenido baja durante los últimos quince años; mientras, la demanda de este producto se mantiene alta, dependiendo en gran medida de las importaciones. La disminución en el número de producción de ganado y carne en el país es notable. Realizar técnicas de reproducción asistida es una estrategia para mejorar la producción local, por lo que es esencial conocer el funcionamiento fisiológico de la célula espermática. El presente estudio evaluó el metabolismo de los espermatozoides bovinos durante la capacitación in vitro mediante el uso de inhibidores enzimáticos [(IE); 3-cloro-1,2-propanodiol (3MCPD), oxamato de sodio (SOXAM), 1-fluoro- 2,4-dinitrobenceno (DNFB)] y desacopladores de la cadena de trasporte de electrones [(DES); rotenona (ROT) y cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP)]. Se utilizaron tratamientos de control [medio capacitante (MC) y MC+dimetilsulfóxido (MC+DMSO)] para comparar el efecto con un medio no capacitante (MNC). El semen de cuatro toros Senepol fue recolectado por electro-eyaculación, se incubó durante 4 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%, y se analizó (1x/Hr) mediante el sistema de “Computer Assisted Sperm Analysis” (CASA) para evaluar los siguientes parámetros: motilidad (MOT), velocidad curvilínea (VCL), amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH), frecuencia del golpe flagelar (BCF) y linealidad (LIN). Los datos se analizaron utilizando el “Proc Mixed” en SAS (Statistical Analysis System). No hubo interacción entre el tratamiento y el tiempo para ninguno de los parámetros de motilidad evaluados. Sin embargo, se observó un efecto de tratamiento para MOT, VCL, ALH, BCF y LIN (P<0.05). De manera similar, se observó un efecto de Hr (P<0.05). Los valores de BCF aumentaron mientras que los valores de MOT, VCL y ALH disminuyeron, lo que indica la hiperactivación de la célula espermática durante la capacitación; para LIN, los valores no demostraron un patrón. Los controles establecidos, MC y MC+DMSO, no mostraron diferencias entre sí para ninguno de los parámetros de motilidad (P>0.05). Aunque, entre estos y MNC hubo una diferencia para todos los parámetros (P<0.0001), excepto para LIN (P=0.6999). Los espermatozoides se vieron afectados según las horas de incubación independientemente del tratamiento: MOT, VCL, ALH, BCF y LIN (P<0.05). Por otro lado, utilizar IE vs. MC no tuvo efecto significativo para MOT y ALH (P=0.0829 y P=0.1865, respectivamente). Sin embargo, para VCL, BCF y LIN hubo diferencias al utilizar los IE vs. MC (P<0.05). Sobre VCL, el SOXAM mostró valores mayores que MC (P=0.0299) y 3MCPD (P=0.0168); este último, también fue menor que DNFB (P=0.0364). No hubo diferencias entre MC vs. 3MCPD y DNF (P=0.9977 y P=0.0612, respectivamente). Aun así, el MC fue menor que 3MCPD para BCF (P=0.0583). Los espermatozoides tratados con SOXAM y DNFB mostraron un mayor porciento de linealidad que MC (P=0.0014 y P=0.0443, respectivamente) y 3MCPD (P=0.0017 y P=0.0513, como corresponde). Estos IE causaron una disminución significativa para MOT, VCL y ALH entre las 1-4 horas de incubación, con una diferencia de 25.19%, 48.51μm/seg, 1.81μm, respectivamente (P<0.0001). Sin embargo, el BCF aumentó 4.57Hz (P<0.0001) y LIN no fue relevante (P=0.3388). Al utilizar DES, en comparación con MC+DMSO, el CCCP redujo 7.61% en MOT (P=0.0115) y 2.55% en LIN (P=0.0075). Por otro lado, VCL disminuyó 13.84μm/seg cuando los espermatozoides fueron tratados con ROT (P=0.0071). Los espermatozoides expuestos a ROT y CCCP no mostraron diferencias en los parámetros de ALH y BCF (P=0.1860 y P=0.3388, respectivamente). Los desacopladores tuvieron un impacto significativo en el tiempo causando una disminución en MOT, VCL y ALH entre las 1-4 horas de incubación con una diferencia de 24.33%, 41.29μm/seg y 1.56μm, respectivamente (P<0.0001). Por otro lado, BCF aumentó 5.45Hz (P=0.0004) y LIN no mostró diferencia (P=0.4793). Estos resultados sugieren que los espermatozoides bovinos pueden mantener su movilidad en ambas condiciones, aeróbica y anaeróbica; aunque se confirma que su vía metabólica principal es la respiración celular, siempre y cuando tengan sustrato glicosilable disponible. Finalmente, un buen manejo de los espermatozoides mejora su capacidad fecundante, lo que probablemente ayude a reducir los problemas de fertilidad en el ganado. Esta estrategia podría contribuir a mejorar el desempeño reproductivo y de esta manera promover la producción y el consumo local de carne de res, lo que puede ayudar a la economía del país.